Bijlage 1 - Experimenteel ontwerp: het modelsysteem

Een belangrijke overweging in een experimentele opzet is welk modelsysteem je gaat gebruiken om je onderzoeksvraag te beantwoorden (zie figuur b1). In de biologie maken we onderscheid tussen in vivo, ex vivo en in vitro systemen en meest recent, door de opkomst van de computer, in silico. Het komt vaak voor in de praktijk dat er verschillende modelsystemen worden gebruikt. De eerste opzet van een experiment wordt in cellijnen uitgevoerd en de belangrijkste bevindingen worden dan nogmaals getest op een “hoger” biologisch niveau bijvoorbeeld op orgaanniveau of op het niveau van een organisme. Bijvoorbeeld, om nieuwe chemicaliën te ontdekken die een bepaald effect hebben op een biologisch proces worden “chemical libraries” getest op cellijnen. Vervolgens worden de meest veelbelovende chemicaliën getest op orgaan en organisme niveau.

Verschillende type modelsystemen. [Bron]( https://www.preprints.org/manuscript/202408.0682/v1)

(#fig:figuur_b1)Verschillende type modelsystemen. Bron

In vivo (Latin for “within the living”)

Een modelorganisme is een eenvoudig, (relatief) handelbaar organisme dat experimenteel werk mogelijk maakt. Een modelorganisme heeft enkele belangrijke universele eigenschappen:

  • relatief klein
  • gemakkelijk en goedkoop op te kweken en te onderhouden
  • veel nakomelingen
  • korte levensduur
  • korte generatie tijd
  • homogeniteit van de populatie
  • beschikbaarheid van het genoom
  • toegankelijk voor genetische manipulatie
  • conservatie van het te bestuderen mechanisme in andere soorten (waaronder mensen)
  • niet-pathogeen voor mensen

De meest gebruikte multicellulaire modelorganisme in het wetenschappelijk onderzoek zijn:

  • rondworm (C. Elegans)
  • fruitvlieg (Drosophila)
  • zebravis (Danio rerio)
  • muis (Mus misculus)
  • rat (Rattus norvegicus)
  • dog (Canis lupus familiaris)
  • mens (Homo sapiens)

(In principe kan elk intact organisme dienen)

De biologische kennis / principes die voortkomenen vanuit het gebruik van modelorganismen bieden ook inzicht in dezelfde processen in andere organismen zoals de mens. Modelorganismen worden ook gebruikt om bepaalde (humane) ziektebeelden te bestuderen. In dit geval is een modelsysteem een vervanging van de mens. Het gebruik van gewervelde proefdieren is wettelijk geregeld en er zijn strenge voorwaarden voor het gebruik van proefdieren. Om het gebruik van proefdieren zo verantwoord mogelijk te maken, zijn de 3 V’s opgesteld:

Vervanging (Replacement) – Indien mogelijk, dierproeven te vervangen door alternatieve methoden, zoals ongewervelde dieren, geadvanceerde celkweken technieken en computermodellen (zie ook in silico analyse)

Vermindering (Reduction) – Het aantal dieren dat wordt gebruikt in experimenten zoveel mogelijk beperken, bijvoorbeeld door efficiëntere testmethoden of betere statistische analyses.

Verfijning (Refinement) – Het lijden van de dieren zoveel mogelijk te verminderen door betere huisvesting, pijnbestrijding en verbeterde experimentele technieken om zoveel mogelijk (repliceerbare) data uit dierproeven te halen

Ex vivo (Latin for “out of the living”):

Organen die uit een organisme worden gehaald en worden bewaard (met beperkte houdbaarheid) onder physiologische condities

In vitro (Latin for “in glass”):

  • cell componenten: organellen, cellulaire extracten, macromoleculen (DNA, RNA, eiwitten)
  • single celcultuur
  • 2D celcultuur: (primaire) cellijnen
  • 3D celcultuur: spheroids, organoids en organ-on-a-chip

In silico (verwijzing naar de computer chips die van silicon zijn gemaakt):

Experiment wat volledig met de computer wordt uitgevoerd:

  • modellering van biologische processen
  • deep learning (voorspellingen en classificaties)
  • vergelijking van biologische sequenties (DNA, RNA, eiwitten)
  • 3D-eiwit structuren

C. Elegans

De nematode C. elegans is een organisme dat vanaf de jaren 60 gebruikt werd als modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie. Voor een korte beschrijving van C elegans als modelorganisme klik hier

Het geslacht van C. elegans is hermafrodiet of een mannetje. De hermafrodieten bevruchten zichzelf of paren met een mannetje. De reproductietijd is 3-4 dagen en de wormpjes produceren meer dan 1,000 eitjes per dag. De wormpjes leven ongeveer 2 weken.

De wormen kunnen gemakkelijk opgegroeid worden op agarplaten die begroeit zijn met bacteriën. Op deze manier kunnen duizenden wormpjes gekweekt worden per experiment. Een voordeel t.o.v. van Drosophila is dat C. elegans ingevroren kan worden zodat transgene stammen voor lange tijd bewaard kunnen worden (de fruitvlieg moet constant gepropageerd worden)

De wormen zijn transparant zodat cellen en eiwitten, bijvoorbeeld tijdens de ontwikkeling, in vivo gevisualiseerd kunnen worden met een microscoop. Deze eigenschap heeft er voor gezorgd dat alle 959 cellen van C. elegans in kaart zijn gebracht tijdens de ontwikkeling. Het complete neurale network bestaat uit 302 neurale cellen en 56 glial cellen en dient als modelsysteem om de werking van neurale netwerken en gedrag te bestuderen.

Het complete genoom werd gepubliceerd in 1998. Het genoom bevat ongeveer 100 miljoen basenparen en 20,500 genen verdeeld over 6 chromosomen (hermafrodiet) of 5 chromosomen (mannetje). De schatting is dat van 65 % van de genen die betrokken zijn bij menselijke ziekte een soortgelijk gen aanwezig is in het genoom van C. elegans.

Om de functie van een gen te bestuderen zijn verschillende “genome editing” technieken beschikbaar. Voor de zogenaamde “loss of function” experimenten is de meest gehanteerde techniek RNAi. De techniek gebruikt dsRNA om het mRNA van een gen van interesse tijdelijk te onderdrukken / neutraliseren Een nadeel is dat de RNAi niet alle mRNA van het gen van interesse weg kan vangen en slechts tijdelijke is (gene knock-down). Voor een volledige deletie van een gen (gene knock-out) zijn alternatieve technieken beschikbaar zoals CRISPR/Cas9 (deze technieken worden in detail in les 4 en les 5 besproken).

Informatie over het C. elegans genoom, de functie van genen en afgeleide eiwitten is aanwezig in de volgende website:

https://wormbase.org/
https://www.ensembl.org/Caenorhabditis_elegans/Info/Index
https://wormbase.org
https://www.wormatlas.org/
http://ortholist.shaye-lab.org/
strain CL4176: https://cgc.umn.edu/strain/CL4176